Skip to content
Home » Light-Seq-technologie voor barcodes en deep-sequencing van geselecteerde celpopulaties in weefsels

Light-Seq-technologie voor barcodes en deep-sequencing van geselecteerde celpopulaties in weefsels

    Light-Seq-technologie voor barcodes en deep-sequencing van geselecteerde celpopulaties in weefsels

    Onder de microscoop observeren onderzoekers vaak verschillende celtypen die zichzelf organiseren in eigenaardige patronen in weefsels, of soms een zeldzaam celtype dat opvalt door een unieke positie in te nemen, een ongebruikelijke vorm te vertonen of een specifiek biomarkermolecuul tot expressie te brengen. Om de diepere betekenis van hun waarnemingen te bepalen, hebben ze benaderingen ontwikkeld om ook toegang te krijgen tot de genexpressiepatronen (transcriptomen) van cellen door de gen-afgeleide RNA-moleculen die in hen aanwezig zijn te analyseren, die ze kunnen matchen met de vormen, ruimtelijke posities en moleculaire cellen van cellen. biomarkers.

    Deze “ruimtelijke transcriptomics”-benaderingen vangen echter nog steeds slechts een fractie van de totale RNA-moleculen van een cel op en kunnen niet de diepte en kwaliteit van de analyse leveren die wordt geboden door single-cell sequencing-methoden, die zijn ontwikkeld om de transcriptomen van individuele cellen geïsoleerd uit weefsels te onderzoeken of biovloeistoffen via next-generation sequencing (NGS) technieken. Evenmin laten ze onderzoekers toe om zich alleen op specifieke cellen te concentreren op basis van hun locatie in een weefsel, wat het nastreven van onsamenhangende celpopulaties of zeldzame, moeilijk te isoleren cellen zoals zeldzame hersencellen met unieke functies, of immuuncellen enorm zou vergemakkelijken. cellen die tumoren binnendringen. Bovendien, omdat de oorspronkelijke weefselomgeving is verstoord, verhinderen veel ruimtelijke transcriptomics en alle single-cell sequencing-methoden dat onderzoekers hun monsters opnieuw bezoeken om vervolganalyses uit te voeren, en ze zijn duur omdat ze gespecialiseerde instrumenten of reagentia nodig hebben.

    Een nieuwe vooruitgang die is geboekt bij het Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering aan de Harvard University overwint deze beperkingen nu met een door DNA-nanotechnologie aangedreven methode genaamd “Light-Seq”. Light-Seq stelt onderzoekers in staat om het volledige repertoire van RNA-sequenties te “geotaggen” met unieke DNA-barcodes die exclusief zijn voor een paar interessante cellen. Deze doelcellen worden geselecteerd met behulp van licht onder een microscoop via een snel en effectief fotocrosslinking-proces.

    Met behulp van een nieuwe DNA-nanotechnologie worden de gebarcodeerde RNA-sequenties vervolgens vertaald in coherente DNA-strengen, die vervolgens uit het weefselmonster kunnen worden verzameld en met behulp van NGS kunnen worden geïdentificeerd. Het Light-Seq-proces kan worden herhaald met verschillende streepjescodes voor verschillende celpopulaties binnen hetzelfde monster, dat intact wordt gelaten voor vervolganalyse. Met een prestatie die vergelijkbaar is met single-cell sequencing-methoden, verbreedt het de diepte en reikwijdte van mogelijke onderzoeken op een weefselmonster aanzienlijk. De methode is gepubliceerd in Natuurmethoden .

    “Light-Seq’s unieke combinatie van functies voorziet in een onvervulde behoefte: de mogelijkheid om op beeldvorming gebaseerde, ruimtelijk voorgeschreven, diepgaande sequentieanalyse uit te voeren van harde, zo niet onmogelijk te isoleren celpopulaties of zeldzame celtypen in geconserveerde weefsels, met één -op-één correspondentie van hun zeer verfijnde genexpressietoestand met ruimtelijke, morfologische en potentieel ziekterelevante kenmerken”, zegt Peng Yin, Ph.D., een van de vier corresponderende auteurs en een kernfaculteitslid van het Wyss Institute, waar zijn groep ontwikkelde Light-Seq. “Het heeft dus het potentieel om het biologische ontdekkingsproces in verschillende biomedische onderzoeksgebieden te versnellen.” Yin is ook hoogleraar systeembiologie aan de Harvard Medical School (HMS).

    Van streepjescode ter plaatse op volgorde zetten ex situ

    Het Light-Seq-project werd geleid door Jocelyn (Josie) Kishi, Ph.D., Sinem Saka, Ph.D., en Ninning Liu, Ph.D. in de groep van Yin aan de Wyss, en Emma West, Ph.D. in het laboratorium van Constance Cepko bij HMS. Eerder hadden Kishi en Saka SABRE-FISH ontwikkeld als een ruimtelijke transcriptomics-methode voor het direct in intacte weefsels afbeelden van genexpressie (ter plaatse). “Met SABRE-FISH waren we nog steeds orden van grootte verwijderd van het vastleggen van de volledige genexpressieprogramma’s van cellen, met vele duizenden verschillende RNA-moleculen per cel. RNA-moleculen zijn gewoon te dicht opeengepakt om in hun geheel te worden vastgelegd met behulp van de huidige beeldvormingstechnieken, ” zei co-eerste en co-corresponderende auteur Kishi. “Light-Seq lost dit probleem op door barcode-etikettering met hoge resolutie te combineren met volledige transcriptoomsequencing via NGS, waardoor we het beste van twee werelden en extra belangrijke voordelen hebben.” Ten tijde van het onderzoek was Kishi een Wyss Technology Development Fellow in het team van Yin, en nu volgt ze een pad naar de commercialisering van Light-Seq samen met enkele van haar co-auteurs.

    “Om de cellen specifiek te sequensen op speciaal geselecteerde locaties van intacte weefselmonsters, hebben we een nieuwe benadering ontwikkeld voor het fotocrosslinken van DNA-barcodes aan kopieën van RNA-moleculen, en een door DNA-nanotechnologie aangedreven procedure die ze en hun bijgevoegde RNA-sequenties leesbaar maakt door NGS, “Zei co-eerste auteur Liu, een postdoctoraal fellow in de groep van Yin die eerder een geparalleliseerd DNA-barcoderingsplatform heeft ontwikkeld voor een superresolutie-beeldvormingsmethode genaamd “Action-PAINT”, dat ook een van de kerncomponenten van Light-Seq werd.

    Ten eerste, DNA-primers “basenpaar” met RNA-moleculen in cellen, en worden uitgebreid om kopieën te maken van de RNA-sequenties die complementaire DNA-sequenties (cDNA’s) worden genoemd. Vervolgens worden DNA-barcodestrengen die een ultrasnel fotocrosslinker-nucleotide bevatten, op hun beurt basenparen met de cDNA’s in de cellen. Deze worden permanent met elkaar verbonden wanneer een doelcel onder de microscoop wordt belicht via een stencilachtig optisch apparaat dat andere, niet-doelwitcellen in het microscopische veld in het donker houdt en hen zo spaart voor de fotocrosslinking-reactie. Na het wassen van de gebarcodeerde DNA-sequenties uit cellen die niet permanent gekoppeld waren ter plaatsekan de procedure worden herhaald met verschillende streepjescodes en lichtpatronen om meer interessegebieden te labelen.

    “Om deze barcode-workflow met NGS te kunnen integreren, hebben we een nieuwe stitching-reactie ontwikkeld die is gebaseerd op DNA-nanotechnologie. Deze innovatie stelt ons in staat om onze barcode-cDNA’s om te zetten in aaneengesloten uitleessequenties. Vervolgens kunnen we de volledige verzameling barcode-dragende cDNA-sequenties van het monster en analyseer ze met standaard NGS-technieken”, legt Saka uit, een van de corresponderende auteurs van het onderzoek en momenteel groepsleider bij het European Molecular Biology Laboratory in Heidelberg, Duitsland. “Uiteindelijk traceert elke streepjescode de volledige transcriptoomuitlezing terug naar de vooraf geselecteerde cellen in het weefselmonster, dat intact blijft voor latere analyses. Dit biedt ons de unieke kans om exact dezelfde cellen opnieuw te bezoeken na sequencing voor validatie of verdere verkenning.”

    Oog complexe weefsels en zeldzame cellen

    Na de eerste validatie van Light-Seq in gekweekte cellen, wilde het team van Yin het toepassen op een complex weefsel en ging het samenwerken met de groep van Constance Cepko, Ph.D. bij HMS. Cepko is een van de corresponderende auteurs van de studie en de Bullard Professor of Genetics and Neuroscience in het Blavatnik Institute van HMS, en onderzoekt de ontwikkeling van het netvlies als een model van het zenuwstelsel. Kishi, Saka en Liu bundelden hun krachten met West in Cepko’s groep om Light-Seq toe te passen op dwarsdoorsneden van het netvlies van de muis en drie hoofdlagen met verschillende functies te profileren. De onderzoekers bereikten een sequentiedekking die vergelijkbaar is met single-cell sequencing-methoden, en ontdekten dat duizenden RNA’s waren verrijkt tussen de drie belangrijkste lagen van het netvlies. Ze toonden ook aan dat na sequentie-extractie de weefselmonsters intact bleven en verder konden worden afgebeeld voor eiwitten en andere biomoleculen.

    “Door Light-Seq tot het uiterste door te voeren, waren we in staat om het volledige transcriptoom te isoleren van een zeer zeldzaam celtype, bekend als ‘dopaminerge amacrinecellen’ (DAC’s), dat extreem moeilijk te isoleren is vanwege de ingewikkelde verbindingen met andere cellen in het netvlies, door slechts vier tot acht individueel gebarcodeerde cellen per dwarsdoorsnede op te halen,” zei West. DAC’s zijn betrokken bij het reguleren van het circadiane ritme van het oog door de visuele waarneming af te stemmen op verschillende blootstellingen aan licht tijdens de dag-nachtcyclus. “Light-Seq heeft ook RNA’s opgepikt die specifiek tot expressie werden gebracht in DAC’s op lage niveaus, evenals tientallen DAC-specifieke biomarker-RNA’s die, voor zover wij weten, nog niet eerder waren beschreven, wat nieuwe mogelijkheden biedt om dit zeldzame celtype te bestuderen .” voegde West toe, die ten tijde van de studie een afgestudeerde student was en vervolgens een postdoctoraal onderzoeker bij Cepko, en die zich nu bij Kishi heeft aangesloten bij haar Light-Seq-commercialiseringsinspanningen.

    Het openen van het veld van ruimtelijke transcriptomics tot NGS voegt ook informatie toe op het niveau van een enkele RNA-soort. “Onze sequentiegegevens toonden duidelijk aan dat Light-Seq natuurlijke variaties in de structuur van RNA’s kan bepalen. In de toekomst zijn we erg geïnteresseerd in het gebruik van Light-Seq om het samenspel tussen het immuunsysteem, ziekteverspreidende cellen en verschillende therapeutische strategieën zoals gen- en celtherapie,” zei Kishi.

    De Light-Seq-technologie die is ontwikkeld in de groep van Peng Yin in het Molecular Robotics Initiative van het Wyss Institute laat opnieuw zien hoe het nastreven van een totaal onconventionele benadering en het gebruik van synthetische biologie kan leiden tot een disruptieve technologie met een groot potentieel voor het bevorderen van zowel fundamenteel onderzoek als klinische geneeskunde.”


    Donald Ingber, MD, Ph.D., Wyss Oprichtend directeur

    Donald Ingber is ook de Judah Folkman Hoogleraar Vasculaire Biologie aan de Harvard Medical School en het Boston Children’s Hospital, en de Hansjörg Wyss hoogleraar bio-geïnspireerde techniek aan de Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.

    bronnen:

    Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering aan Harvard

    Referentie tijdschrift:

    Kishi, JY, et al. (2022) Light-Seq: Lichtgestuurde in-situ-barcodering van biomoleculen in gefixeerde cellen en weefsels voor ruimtelijk geïndexeerde sequencing. Natuur Methoden. doi.org/10.1038/s41592-022-01604-1.

    .